利用這些miRNA表達克隆研究相應基因或者蛋白的表達調節情況。配合采用熒光素酶報告基因的靶標克隆,可以和miRNA表達克隆一起進(jìn)行miRNA功能篩選合確證,以及miRNA靶標基因的篩選和確證的交互實(shí)驗。
復能基因同時(shí)也提供多套的人類(lèi)基因組和小鼠基因組的全長(cháng)基因ORF表達克隆。用于miRNA靶標的對應蛋白的功能互補實(shí)驗。由于這些ORF克隆不含3’-UTR,可以用于特種miRNA對內源靶基因抑制后的拯救實(shí)驗,進(jìn)一步確證miRNA功能及靶標基因。
復能基因采用基于貓免疫缺陷病的慢病毒系統,構建了miRNA前體表達克隆的載體骨架。RNA聚合酶III型的H1啟動(dòng)子驅動(dòng)轉錄前體miRNA的莖環(huán)前體(大約有150核苷酸長(cháng)度)。 隨后通過(guò)RNAi的酶系加工生成成熟的miRNA。使得在同一載體的CMV啟動(dòng)子的驅動(dòng)下共表達報告基因eGFP,雙順?lè )醋酉掠蔚男旅顾睾Y選基因也同時(shí)表達??勺鳛楸O測miRNA表達,轉染和轉化的效率的參考標準。
RISC-miRNA復合體通過(guò)結合靶基因的mRNA的3’非編碼區(3’-UTR)成功地調節靶基因。1)表達水平和翻譯水平的抑制;2)mRNA的被切割,被降解和豐度的下降。
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