關(guān)于雙熒光素酶報告系統的那些百問(wèn)百答

　　1：雙熒光素酶報告基因適反應溫度？

　　A：室溫（20-22℃）。反應時(shí)各個(gè)組分（細胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調整到室溫。此兩種熒光素酶的反應速率是受溫度影響的，為了保證實(shí)驗的一致性，我們推薦此兩種工作液在檢測時(shí)都孵育至室溫。

　　2：雙熒光素酶報告基因載體該如何選擇？

　　A：1）螢火蟲(chóng)熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4或者自己構建的載體

　　2）海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4載體或者自己構建相應的載體。建議海腎載體不使用強啟動(dòng)子（如SV40、CMV），而選用中等強度的啟動(dòng)子（如TK）。

　　3：檢測的熒光數值很低怎么辦？

　　A：檢測的熒光數值很低說(shuō)明細胞裂解液中的熒光素酶含量很低。通常解決辦法為

　　1）轉染的質(zhì)粒采用細胞轉染級別的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提。

　　2）優(yōu)化轉染條件，盡可能的提高轉染效率。

　　3）增加實(shí)驗的細胞量，并且裂解細胞時(shí)，適當減少細胞裂解液的量。

　　4：進(jìn)行檢測的過(guò)程中，熒光信號值太高該如何進(jìn)行調整？

　　A：1）在轉染實(shí)驗后，減少細胞的孵育時(shí)間。

　　2）降低熒光信號采集時(shí)間。

　　3）進(jìn)行樣品的稀釋。

　　5：螢火蟲(chóng)熒光素酶讀值和海腎熒光素酶讀值的比例多少時(shí)比較合適？

　　A：盡量保證對照組的螢火蟲(chóng)熒光素酶的讀值和海腎熒光素酶的讀值接近，或者海腎熒光素酶的讀值比螢火蟲(chóng)熒光素酶的讀值稍高。對于具體的實(shí)驗過(guò)程中，由于螢火蟲(chóng)熒光素酶質(zhì)粒和海腎熒光素酶的質(zhì)粒抽提的質(zhì)量不一致，待檢測目的調控元件的調控能力的不同等原因，一次實(shí)驗很難達到一個(gè)比較好的實(shí)驗結果，因此對于此實(shí)驗，我們推薦預實(shí)驗優(yōu)化螢火蟲(chóng)熒光素酶質(zhì)粒和海腎熒光素酶質(zhì)粒的共轉染量。