雙熒光素酶報告系統通常以螢火蟲(chóng)螢光素酶為報告基因，以海腎螢光素酶為內參基因。所構成的報告系統具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍廣、應用靈活等優(yōu)勢，廣泛用于基因調控、非編碼RNA靶向互作等研究領(lǐng)域。 1、報告基因檢測受多種因素影響（載體狀態(tài)、細胞狀態(tài)、轉染量、轉染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過(guò)程等），因此同批次樣品檢測值也可能出現浮動(dòng)。所以實(shí)驗一般需要做3個(gè)或3個(gè)以上復孔。
2．細胞培養時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，12-36h內好；長(cháng)時(shí)間培養后，細胞難裂解
3．雙熒光素酶報告基因的載體選擇：
a)螢火蟲(chóng)熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4的載體或自己構建相應的載體；
b)海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4代載體或自己構建相應的載體。建議海腎載體不使用強啟動(dòng)子（如SV40、CMV），而選用中等強度的啟動(dòng)子（如TK）
4．雙熒光素酶報告基因的載體比例：根據實(shí)驗具體情況調整。建議作一個(gè)預實(shí)驗來(lái)調整（螢火蟲(chóng)載體與海腎載體比例分別用1：10、1：20、1：50、1：100），螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測發(fā)光值大于海腎熒光素酶發(fā)光值的比例較好。
5．反應溫度：室溫（20-22℃）。各個(gè)組分（細胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調整到室溫。
6．雙熒光素酶反應體積：20ul（細胞裂解產(chǎn)物）-100ul（螢火蟲(chóng)熒光素酶底物）-100ul（海腎熒光素酶底物），底物量可根據實(shí)際情況調整，但一定要保證底物過(guò)量，不然會(huì )造成檢測結果出現大的偏差。
7．細胞裂解產(chǎn)物存放：常溫不超過(guò)6小時(shí)；-20℃一個(gè)月；-80℃半年。
8．裂解產(chǎn)物與底物混合（手動(dòng)加樣）：要求混合快速、混合時(shí)間一致，避免熒光素酶衰變的影響。
9．發(fā)光半衰期：
a)單熒光素酶檢測，螢火蟲(chóng)熒光素酶的發(fā)光半衰期約12min
b)雙熒光素酶檢測，螢火蟲(chóng)熒光素酶的發(fā)光半衰期約9min，海腎熒光素酶的發(fā)光半衰期約2min
10．檢測結果
樣品檢測發(fā)光值應該遠大于儀器背景值，例如10000。如果樣品發(fā)光值。
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