磷酸化蛋白檢測試劑盒的使用離不開(kāi)離心管法

        磷酸化蛋白檢測試劑盒適用于從各種原代或傳代細胞和各種實(shí)體組織，如腦、脊髓、神經(jīng)結或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結締組織等哺乳動(dòng)物組織中提取磷酸化蛋白。提取過(guò)程簡(jiǎn)單方便，可在1小時(shí)內完成。該試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。本試劑盒含有的*配方能夠溶解細胞膜包括細胞質(zhì)膜和核膜。提取的蛋白可用于WesternBlotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。

　　一、試劑準備

　　1.1配制適當體積的2.0mol/LNaOH、4.7mol/LHCl和50mmol/LTris-HClBuffer（pH7.5）溶液。

　　1.2按照以下公式計算所需的檢測液總體積。

　　檢測液總體積=（標準曲線(xiàn)測定點(diǎn)數+樣品數+空白數）×重復次數×每個(gè)樣品所需的檢測液體積

　　1.3根據所需的檢測液總體積，取1體積試劑A和3體積試劑B，充分混勻，制成檢測液。

　　1.4取7支1.5mL離心管，按照下表平行操作。

　　管號

　　所加溶液0123456

　　0.05MTris-HClBuffer（?L）500495490480470460450

　　磷酸化標準蛋白溶液（?L）

　　磷酸化標準蛋白終濃度（?g/ml）01020406080100

　　二、離心管法

　　2.1制作標準曲線(xiàn)

　　2.1.1取7支1.5mL離心管，各管分別加入200?L各濃度的磷酸化標準蛋白溶液。

　　2.1.2各管加入200?L2.0mol/LNaOH，混勻。

　　2.1.365℃水浴，保溫30min。

　　2.1.4待溶液冷卻至室溫后，各管加入200?L4.7mol/LHCl，混勻。

　　2.1.5各管加入200?L檢測液，混勻。

　　2.1.6室溫靜置30min，期間混勻1-2次，進(jìn)行吸光度值檢測前再混勻1次。

　　2.1.7以0號管作為空白對照，在分光光度計上測各管的A620值。

　　2.1.8重復步驟2.1.1-2.1.7，并計算出編號相同的兩管中磷酸化標準蛋白濃度的A620值的平均值。

　　2.1.9以各管A620平均值為縱坐標，對應的磷酸化標準蛋白終濃度為橫坐標，在坐標紙上或MicrosoftExcel軟件中繪制標準曲線(xiàn)。

　　2.2未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定

　　2.2.1將待測樣品做適當倍數的稀釋或濃縮。

　　2.2.2取3支1.5mL離心管，其中一管加入200?L0.05M的Tris-HClBuffer作為空白對照，其余兩管分別加入200?L相同濃度的待測樣品稀釋液或濃縮液。

　　2.2.3按照步驟2.1.2-2.1.6進(jìn)行實(shí)驗。