免疫組化染色流程中的難題及防范措施

　　一無(wú)色片

　　染色結束后，切片中見(jiàn)不到任何陽(yáng)性信號。這是比較常見(jiàn)的現象，出現這種現象，有兩種可能：1、真陰性結果：整個(gè)染色過(guò)程沒(méi)有出現問(wèn)題，組織或細胞確實(shí)不表達與抗體相關(guān)的抗原。2、假陰性結果：即此陰性結果不是真實(shí)的反映。假陰性結果又可分為兩種情況：（1）切片中根本就不包含所預期檢查的組織或細胞。出現這種情況，可能是實(shí)驗人員選擇錯了切片或選錯了抗體。獲得正確的切片進(jìn)行染色是獲得正確結果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片是至關(guān)重要的。（2）染色過(guò)程中的某一或某些環(huán)節出了問(wèn)題。比如，組織未進(jìn)行抗原修復，有的組織必須經(jīng)過(guò)抗原修復才能檢測抗原表達；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，抗體長(cháng)期不用和/或已超過(guò)有效期是主要的原因。也可見(jiàn)于染色過(guò)程中漏掉了某一環(huán)節，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時(shí)少了過(guò)氧化氫。為了避免這種簡(jiǎn)單的錯誤，有一種簡(jiǎn)單的方法：在三抗孵育結束時(shí)，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀(guān)察是否出現棕色。如果出現了，證明三抗和DAB的配制過(guò)程沒(méi)有錯誤。如果這種DAB再滴到切片上沒(méi)有出現任何陽(yáng)性信號，問(wèn)題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現棕色反應，問(wèn)題肯定在三抗或DAB的配制過(guò)程。這種簡(jiǎn)單方法能迅速的幫助我們查找出現問(wèn)題可能的原因。

　　解決陰性染色的問(wèn)題非常簡(jiǎn)單，就是設立“陽(yáng)性對照”。如果陽(yáng)性對照有了表達，說(shuō)明染色的全過(guò)程和所有試劑都沒(méi)有問(wèn)題。如果此時(shí)待測樣本仍為陰性，便是真實(shí)的陰性，說(shuō)明組織或細胞沒(méi)有相應的抗原表達。反之，如果陽(yáng)性對照沒(méi)有著(zhù)色，表明染色過(guò)程中某個(gè)或某些步驟出了問(wèn)題或試劑出了問(wèn)題。應一一尋找原因。陽(yáng)性對照包括兩種，一種稱(chēng)為“自身對照”或“內部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結中存在T和B細胞抗原，CD20或CD3都應該有表達。自身對照是一種比較理想的對照，對照和測試組織或細胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗條件下，結果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對照片時(shí)選擇既有病變組織同時(shí)又有正常組織的部分，這樣有利于對比。另一種稱(chēng)為“外部對照”，有時(shí)在待測的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來(lái)檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關(guān)的抗原，如果病變出現陽(yáng)性反應結果，尚能提示是惡黑，但是如果出現陰性結果，就無(wú)法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術(shù)問(wèn)題。因此，應另外設立一個(gè)已知的陽(yáng)性對照。這種在測試組織之外的陽(yáng)性對照稱(chēng)為“外部對照”。在實(shí)際工作中需要設立外部對照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽(yáng)性對照，工作量會(huì )很大。為了解決這個(gè)問(wèn)題，目前國內外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片等，其連續切片儲備待用，需要時(shí)取出一張便可作為陽(yáng)性對照。另外，比較簡(jiǎn)單的方法，是采用闌尾作為陽(yáng)性對照，因為與人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類(lèi)較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數常用的抗體。