蛋白質(zhì)磷酸化由蛋白質(zhì)激酶所催化，磷酸化多發(fā)生在多肽鏈絲氨酸，蘇氨酸的羥基上，偶爾也發(fā)生在酪氨酸殘基上，這種磷酸化的過(guò)程受細胞內一種蛋白激酶催化，磷酸化后的蛋白質(zhì)可以增加或降低它們的活性，例如：促進(jìn)糖原分解的磷酸化酶，無(wú)活性的磷酸化酶b經(jīng)磷酸化以后，變成有活性的磷酸化酶a。而有活性的糖原合成酶I經(jīng)磷酸化以后變成無(wú)活性的糖原合成酶D，共同調節糖原的合成與分解。以下簡(jiǎn)要介紹幾種常用的磷酸化蛋白多重檢測的方法。
1.westernblot
檢測蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法是westernblot，過(guò)程是先用SDS-PAGE分離生物樣品，接著(zhù)轉移到膜上，后利用磷酸化特異的抗體來(lái)鑒定目的蛋白。典型的Westernblot實(shí)驗步驟避免了使用放射性同位素時(shí)的危險品和廢物處理要求。磷酸化特異抗體大多十分靈敏，可輕松檢測常規樣品中的磷酸化蛋白。
2.酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)
ELISA的定量能力比Westernblot更強，非常有助于研究激酶活性調節及其功能。這種微孔板形式的分析一般是利用目的蛋白特異的捕獲抗體，和磷酸化狀態(tài)無(wú)關(guān)。隨后讓目的蛋白結合在抗體包被的分析板中，加入待分析的磷酸化位點(diǎn)特異的檢測抗體。這些分析通常設計為顯色或熒光檢測。產(chǎn)生的信號強度與初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。
3.激酶活性分析
蛋白激酶通常是多個(gè)信號轉導網(wǎng)絡(luò )的常見(jiàn)組分，它們影響了眾多負責生物反應的下游效應物，因此，評估某個(gè)特定激酶的活性可能為平行通路提供寶貴信息。生物學(xué)樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在A(yíng)TP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過(guò)一些報告系統來(lái)評估特定激酶對底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。
4.磷酸化特異抗體的開(kāi)發(fā)
20世紀90年代，科學(xué)家利用合成的磷酸化肽段來(lái)免疫兔子，開(kāi)發(fā)出多個(gè)磷酸化狀態(tài)特異抗體，這些磷酸化肽段代表了目標蛋白磷酸化位點(diǎn)周?chē)陌被嵝蛄?。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產(chǎn)生高度特異的免疫試劑。磷酸化特異抗體的出現為傳統方法的改進(jìn)以及新的免疫分析技術(shù)的開(kāi)發(fā)打開(kāi)了大門(mén)。在任何技術(shù)中使用磷酸化特異抗體都要注意，成功的檢測依賴(lài)于抗體與目的磷酸化蛋白的特異性和親和力。

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