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蛋白共提取試劑盒對于體外培養細胞的方法
發(fā)布日期:
2018-05-21
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2307
蛋白共提取試劑盒是從培養細胞和動(dòng)物組織樣品同時(shí)抽提RNA和DNAzui為快速簡(jiǎn)單的方法。本試劑盒基于硅膠柱純化技術(shù),提取過(guò)程中無(wú)需使用有毒的酚氯仿抽提,也無(wú)需進(jìn)行耗時(shí)的醇類(lèi)沉淀,整個(gè)過(guò)程只需35分鐘。該方法得到的RNA可直接用于RT-PCR, Northern blot, poly-A 純化,核酸保護和體外翻譯等實(shí)驗。
1.根據用量取適當的漿蛋白抽提試劑和核蛋白抽提試劑加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM。PMSF需現用現加,若目標蛋白含有豐富的半胱氨酸,可以在兩種蛋白抽提液中加入DTT至終濃度0.5mM。
2.對于貼壁細胞,去除培養液,用PBS洗一遍,用細胞刮刀收集細胞,或用EDTA消化后吹打下細胞(不用胰酶硝化,以免胰酶消化目的蛋白)。500g離心2~3分鐘收集細胞,吸盡上清留下沉淀備用。
3.對于懸浮細胞:用PBS洗一遍,500g離心2~3分鐘收集細胞,吸盡上清,留下細胞沉淀備用。
4.每20ul細胞沉淀加入200ul漿蛋白抽提試劑(2×106個(gè)細胞沉淀約20ul或40mg)。
5.用移液器吹打或高速渦旋15秒(可適當延長(cháng)),必須使細胞沉淀*分散開(kāi)成單細胞懸液。細胞沉淀分散不*會(huì )導致蛋白產(chǎn)量降低。
6.冰浴10分鐘。
7.zui高轉速劇烈渦旋10秒,4℃12000~16000g離心10分鐘。
8.上清即為抽提得到的細胞漿蛋白,立即吸取上清至預冷的樣品管中備用,進(jìn)行后續的PAGE、Western等實(shí)驗,但蛋白濃度較低,可根據需要進(jìn)行相應濃縮。
9.沉淀即為細胞核,要*吸盡殘余的上清(避免細胞漿蛋白的污染),加入50-100ul核蛋白抽提試劑。
10.用移液器吹打或高速渦旋15秒(可適當延長(cháng))至沉淀*分散,冰浴10分鐘。
11.zui高轉速劇烈渦旋10秒,4℃12000~16000g離心10分鐘。
12.立即吸取上清至預冷的樣品管中,此即為抽提得到的細胞核蛋白??蛇M(jìn)行后續實(shí)驗或-70℃凍存。