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磷酸化蛋白檢測試劑盒采用酶標儀法的具體步驟
發(fā)布日期：
2017-10-14
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1975
磷酸化蛋白檢測試劑盒首先用熱堿將磷酸化蛋白中的磷酸基團水解下來(lái)，再通過(guò)染料分子與游離的磷酸分子結合，形成染料-磷酸復合物。本試劑盒具有操作簡(jiǎn)單快速、定量范圍大、線(xiàn)性好和實(shí)驗方案靈活等特點(diǎn)。
1.選取18個(gè)酶標孔，分為標準組和樣品組，依次分別標號1-7,8-9，均設置重復管號。樣品實(shí)驗前可做適當稀釋或濃縮，樣品可取2個(gè)不同濃度梯度。標號為8-9。標準組各管分別加入50 μl各濃度的磷酸化標準蛋白溶液；樣品組分別加入50μl磷酸化蛋白樣品。
2.各管加入50 μl 2.0 mol/L NaOH，混勻。 65℃水浴，保溫30 min。
3.待溶液冷卻至室溫后，各管加入50 μl 4.7 mol/L HCl，混勻。
4.各管加入50 μl檢測液，混勻。室溫靜置30 min，期間混勻1-2次，進(jìn)行吸光度值檢測前再混勻1次。
5.以0號管作為空白對照，在分光光度計上測各管的A620值。
6.以標準組各管A620平均值為縱坐標，對應的磷酸化標準蛋白終濃度為橫坐標，在酶標儀上或Microsoft Excel軟件中繪制標準曲線(xiàn)，由樣品管各管A620平均值計算樣品中磷酸化蛋白的濃度。
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